Du 1 au 3 Octobre 1998
GEHT - Marseille
Résumé réunion de travail GEHT

GROUPE DE TRAVAIL SUR LE DIAGNOSTIC BIOLOGIQUE DE LA MALADIE DE WILLEBRAND
D. Meyer, E. Fressinaud, C. Mazurier

Douze* centres ont participé à une étude multicentrique sur les dosages de Facteur Willebrand (vWF). Ces centres ont été sélectionnés pour leur contribution active au réseau INSERM sur les anomalies moléculaires de la maladie de Willebrand coordonné par D. Meyer. Chaque centre
a reçu des aliquots de 8 échantillons congelés provenant :
- de patients bien caractérisés (2 types 2M, 1 type 1, 1 type 3) ou dont la caractérisation est
en cours chez 1 patient porteur d’un facteur rhumatoïde,
- d’un plasma immunodéplété en vWF (gracieusement fourni par le LFB) ayant un taux résiduel de vWFAg de 2,9%,
- d’un pool de 3 sujets normaux (non dilué et dilué au 1/2 dans le plasma immunodéplété).

Les 12 centres ont réalisé sur chaque échantillon les dosages de vWFAg et vWFRCo, dans leurs conditions de routine avec la technique de leur choix.

Trois centres ont également réalisé un dosage du vWFCBA (collagen-binding assay)

1) Dosage de vWFAg
Pour le dosage du vWFAg, 3 types de techniques ont été utilisés :
1. LIATEST (Latex Immuno Assay) (Diagnostica Stago) sur automate STA : 5 centres
2. ELFA (Enzyme Linked Fluorescent Assay) sur automate VIDAS (Biomérieux) : 4 centres
3. ELISA
Asserachrom vWF (Diagnostica Stago) : 7 centres
" Maison " : 1 centre

Chaque technique était réalisée soit en première intention (LIATEST, ELFA ou ELISA),
soit en contrôle de la précédente (ELFA ou ELISA).

Les résultats sont résumés dans le tableau I (moyenne, valeurs extrêmes, coefficient de variation). Pour des valeurs de vWFAg de 5 à 120 %, les trois techniques ont des performances identiques. Pour des taux de vWFAg < 5%, seul l’ELISA a une sensibilité suffisante, faisant bien la différence entre un échantillon qui a environ 3% (échantillon 4 : plasma immunodéplété en vWF) et un échantillon qui a un taux < 1% (échantillon 8 : type 3). Cependant parmi les 8 laboratoires ayant réalisé une technique ELISA, 6 ont bien exploité la haute sensibilité du test, mais 2 ont attribué des valeurs identiques aux échantillons 4 et 8 (< 5% ou < 1%) du fait d’une gamme d’étalonnage non appropriée à cette zone et de dilutions trop fortes des échantillons. Il faut souligner que la spécificité du LIATEST a été en défaut pour l’échantillon avec présence de Facteur rhumatoïde (échantillon 7) ; pour cet échantillon dont le taux moyen de vWFAg était de 28% (21-33%) par ELFA Vidas ou ELISA Asserachrom, le taux a été largement surestimé par LIATEST : 87% (69-116%). Mais parmi les 5 laboratoires utilisant la technique LIATEST, 4 n’ont pas validé ce résultat et ont contrôlé le dosage par ELFA ou ELISA. Un seul laboratoire
a rendu un résultat erroné.

Toutes techniques confondues, le coefficient de variation est en moyenne < 10 % (en excluant l’échantillon 7), ce qui est tout à fait acceptable pour une étude inter-laboratoire. Les avantages et inconvénients des 3 techniques sont résumés dans le tableau II.

2) Dosage du vWFRCo
Deux techniques ont été utilisées :

l’agrégométrie : 11 centres
l’agglutination sur lame : 2 centres (1 centre ayant réalisé les 2 techniques).

- En agrégométrie, tous les centres ont utilisé les plaquettes lyophilisées Behring, à l’exception d’un centre qui a utilisé des plaquettes fraîches. Les agrégomètres étaient de 5 marques (Labintec, Biodata, Affi-bio, Regulest, Helena). La technique semble bien pouvoir être adaptée sur tous types d’agrégomètre. L’étalon est soit un étalon commercial lyophilisé (Immuno, Behring) soit un pool congelé qui n’est pas toujours calibré avec le standard international. Les dilutions de la gamme d’étalonnage ou des échantillons ne sont pas toujours judicieusement choisies, ce qui explique les différences de sensibilité. Cependant la limite de quantification semble clairement de 5 à 6%, bien que 6 centres aient affiché des sensibilités de 3%, voire 1%.

- Les 2 centres qui ont utilisé l’agglutination sur lame ont fourni des renseignements intéressants. Un centre a utilisé les plaquettes lyophilisées Behring et l’autre des plaquettes " maison " fixées et congelées. Cette technique (qui est la seule adaptée à l’urgence) a donné dans les 2 centres des résultats comparables à l’agrégométrie avec peut-être une tendance à surestimer les taux les plus élevés (échantillon 3). Par contre, la sensibilité serait supérieure à celle de l’agrégométrie, avec une limite de quantification (déterminée par dilution d’un plasma normal) de l’ordre de 1% (ce qui n’a vraisemblablement pas d’intérêt en pratique).

En regroupant les 2 techniques (Tableau I) le coefficient de variation est en moyenne de l’ordre de 30% (avec des extrêmes de 10,7 à 79, 9%) ce qui pouvait être attendu si l’on se réfère à d’autres études.

3) Dosage du vWFCBA
Trois centres ont réalisé ce dosage. Deux ont utilisé une technique ELISA " maison " avec un collagène humain de type III d’origine placentaire. Le troisième a d’une part utilisé un kit commercial (Immuno France) dont la source de collagène (type III) est aussi du placenta humain, et d’autre part un ELISA " maison " avec un collagène de type I et dont la source est du rat. Les coefficients de variation sont très variables : en moyenne de 23,3% mais avec des extrêmes de 3,6% à 42,7% (Tableau I).

Il a été proposé par des équipes étrangères de remplacer le vWFRCo, peu reproductible, par le vWFCBA, qui devrait avoir, comme toutes les techniques ELISA, une reproductibilité supérieure. Actuellement la technique n’est pas assez standardisée. Elle n’est pas non plus validée dans tous les types de maladie de Willebrand.

En conclusion
Douze laboratoires très entraînés à la réalisation de ces dosages du fait de leur recrutement de patients, ont participé à cette étude multicentrique. La recommandation principale est que le diagnostic biologique de la maladie de Willebrand doit faire appel à une stratégie. L’utilisation du seul dosage du vWFAg en dépistage est insuffisante quelque soit du reste la technique utilisée ; il doit être systématiquement couplé au dosage du vWFRCo. Si le dosage du vWFAg est réalisé par une technique LIATEST et montre une discordance avec le dosage du vWFRCo, un contrôle du vWFAg doit être réalisé par une technique plus spécifique (ELFA Vidas ou ELISA Asserachrom). Pour des taux de vWFAg < 5%, le dosage doit être réalisé en ELISA Asserachrom en veillant à adapter la gamme d’étalonnage et les dilutions de l’échantillon.

Le dosage du vWFRCo en agrégométrie peut être réalisé sur tous les agrégomètres en utilisant un pool ou un étalon calibré contre le standard international, des dilutions judicieuses de l’étalon (1/4, 1/8, 1/16, 1/32) et des échantillons (1/1 à 1/32…) ; la limite de détection est de l’ordre de 5 à 6 %. L’agglutination sur lame (technique adaptée à l’urgence)donne des résultats comparables (à condition de réaliser de nombreuses dilutions de l’échantillon pour améliorer la précision).

Le dosage du vWFCBA ne présente actuellement pas d’intérêt dans la stratégie diagnostique.


* Angers, Bicêtre, Bordeaux (Hôpital Pellegrin), Bordeaux-Pessac, Caen, Clamart, Lille (LFB), Lille (CHU Huriez), Marseille, Nantes, Paris (Hôtel-Dieu), Paris (Necker).