31 Mars 2005 Paris

Diagnostic biologique de la maladie de Willebrand :
type 1 (résultats du réseau européen)
D. Meyer, C. Mazurier

Introduction
D. Meyer, C. Mazurier
Le type 1 de la maladie de Willebrand (VWD) fait l'objet d'une étude multicentrique européenne coordonnée par le Pr Ian Peake (Université de Sheffield, Royaume-Uni) rassemblant 12 laboratoires européens, dont ceux de Bicêtre et de Lille, et financée par la communauté européenne. Une cohorte de 153 familles, classées type 1 de VWD au début de l'étude, a été caractérisée sur le plan phénotypique et génotypique.

Anomalies moléculaires. Caractérisation de quelques mutations
A.S. Ribba
Le séquençage des 52 exons du gène du facteur Willebrand (VWF) et de sa région promotrice chez les 153 cas index de la cohorte a révélé 84 hétérozygotes pour une mutation, 18 hétérozygotes composites (les 2 allèles du gène étant mutés), 2 cas ayant trois mutations et 49 patients n'ayant aucune mutation du gène du VWF. Ainsi quatre-vingts anomalies moléculaires distinctes du gène du VWF ont été identifiées dont 59 mutations faux-sens, 6 mutations de sites de splicing intron-exon, 5 délétions, 5 mutations du promoteur, 4 mutations non-sens et 1 insertion. A l'exception des mutations du promoteur, les anomalies moléculaires sont réparties sur l'ensemble de la molécule du VWF, 25 sont localisées sur le propeptide et l'extrémité N-terminale du VWF, 29 sur sa partie centrale et 21 sur son extrémité C-terminale. Parmi les 59 mutations faux-sens, 47 sont nouvelles, 9 sont déjà bien caractérisées et connues comme étant les plus fréquentes du type 2 de VWD, enfin les 3 substitutions C1130F, R1205H et Y1584C sont extrêmement fréquentes et déjà identifiées dans des familles canadiennes et européennes ayant un type 1 de VWD. L'expression et la caratérisation des VWF recombinants porteurs d'une des mutations identifiées sont en cours. Les premiers résultats montrent que ces anomalies semblent être responsables d'une clairance augmentée du VWF ou bien d'un défaut de biosynthèse associé à une anomalie de multimérisation du VWF.

Expression de 10 mutations dans la partie C-terminale du VWF
L. Hilbert, C. Mazurier
Chez des patients de type 1 VWD étudiés dans cadre du projet européen, 19 nouvelles anomalies moléculaires ont été identifiées dans la partie C-terminale (domaines D4 à CK) du VWF. Huit d’entre elles ont été exprimées à Lille (LFB) par transfection transitoire de cellules Cos-7.
L’analyse des taux de VWF:Ag secrété dans le milieu de culture et présent dans les lysats cellulaires et du profil multimérique des recombinants (rVWF) extra- et intra-cellulaires mutés a permis de distinguer

Un 1er groupe de 5 mutations (L2207P, C2304Y, G2441C, S2469P et C2477Y) pour lesquelles
- la secrétion dans le milieu de culture est très diminuée et il existe une rétention intra-cellulaire,
- le profil multimérique est anormal avec une diminution des multimères de haut poids moléculaire (milieu et lysat),
- la mobilité électrophorétique de chacun des multimères est augmentée (milieu et lysat).

Un 2ème groupe de 2 mutations (G2518S et Q2520P) pour lesquelles
- le défaut de secrétion dans le milieu de culture n’est que modéré,
- le profil multimérique et la mobilité électrophorétique des différents multimères est normale ou sub-normale.

La mutation R2464C pour laquelle
- le taux d’expression et la multimérisation sont normales,
- la mobilité électrophorétique du rVWF intra-cellulaire est normale mais celle du rVWF secrété est anormale.

Les co-transfections Vol/Vol de l’ADN muté et de l’ADN normal, pour reproduire le VWF « hybride » présent dans les malades hétérozygotes pour la mutation, permettent de corriger partiellement ces défauts.

Conclusion : Certaines de ces mutations induiraient plutôt un type 2A de VWD qu’un type 1.

Caractéristique des 10 familles française incluses (phénotype, génotype)
J. Goudemand, E. Fressinaud

Les familles entrées dans l’étude européenne sur la VWD de type 1 devaient correspondre aux critères suivants :
- au moins 2 membres atteints (dont le propositus)
- au moins 2 membres non atteints
- diminution du VWF :Ag et VWF :RCo < 2 SD avec un rapport VWF :Ag/VWF :RCo > 0.7
- profil multimérique normal
- pas d’agrégation plaquettaire aux faibles concentrations de ristocétine

Les données phénotypiques sont de 3 niveaux :
- les données historiques (utilisées pour la sélection des familles)
- les données recueillies localement le jour de l’inclusion
- les données résultant des dosages centralisés
Chaque membre de la famille a été soumis à un questionnaire clinique destiné à quantifier le syndrome hémorragique. Un système de score hémorragique a été établi pour cette étude : chaque manifestation hémorragique étant cotée de -1 pour certaines à +4 (12 items).

Neuf familles ont été entrées dans cette étude en France. Le phénotype des 9 cas index montre que :
- pour tous le rapport VWF :CB/VWF :Ag est supérieur ou égal à 1
- le rapport VWF :RCo/VWF :Ag est > 0.7 chez 7 mais < 0.7 chez deux patients pour lesquels le dosage centralisé du VWF :RCo a trouvé des taux plus bas que ceux primitivement identifiés par le centre recruteur.
- le rapport FVIII :C/VWF :Ag est > 2 chez 8 patients et < 1 chez deux (chez lesquels une diminution de la liaison du VWF au FVIII a été ultérieurement retrouvée).

Les anomalies génotypiques identifiées sont les suivantes:
- R854Q et G2561A (propositus et fratrie)
- C2304Y (propositus et ascendants)
- P1266L et R1315H (propositus et enfants)
- R1342C (propositus)
- G2518S (propositus)
- G2380+1 splice (propositus en enfant)
- L2207P (propositus)
- G2441C (propositus, ascendants et enfants)
- R854Q (propositus, ascendants et fratrie) et Y1584C (autres membres de la fratrie) ; 1 individu étant porteur des 2 mutations

La mutation R854Q est associée à une diminution partielle de l’interaction entre VWF et FVIII.
Une anomalie de la composition multimérique a été mise en évidence chez certaines familles.

Il est enfin intéressant d’observer la dissociation entre le score hémorragique et le phénotype d’une part entre les familles mais aussi à l’intérieur d’une même famille entre des individus dont le phénotype est comparable.

Bien évidemment ces données devront être réintégrées dans l’ensemble des 154 familles européennes entrées dans le projet.

Influence du génotype sur la réponse à la desmopressine
E. Fressinaud, J. Goudemand
La réponse à la desmopressine a été étudiée dans le cadre de cette étude multicentrique européenne chez 48 patients non apparentés. Elle semble influencée par la localisation de la mutation au niveau du gène du VWF. Les patients avec une mutation dans les domaines D1-D2 (propeptide) et D4-CK (extrémité C-terminale) sont meilleurs répondeurs que les patients porteurs d’une mutation au niveau des domaines D3, A1 et A2.

Conclusions
D. Meyer, C. Mazurier
Cette étude devrait permettre de redéfinir le type 1 de VWD, et de mieux comprendre ses mécanismes physiopathologiques. Les différentes études sur la VWD, européenne (type 1), française (type 2) et canadienne (type 1) vont conduire à revoir et proposer une nouvelle classification de la VWD.