 Endothélium et Pathologies Vasculaires
Du 1 au 3 Octobre 1998
GEHT - Marseille
ATELIER CYTOMETRIE EN FLUX
Compte-rendu de la réunion de Marseille
L’atelier de cytométrie en flux ayant eu lieu à Marseille le 1er octobre avait pour but de faire le point des technologies communes utilisées dans différents laboratoires du GEHT pour la recherche de microparticules et l’évaluation de plaquettes réticulées par cytométrie en flux dans le sang circulant. Les difficultés proviennent du fait qu’à ce jour ; il n’y a aucun consensus sur aucune de ces techniques. Il s’agit d’investigations récentes qui du fait de leur intérêt en clinique suscitent un grand engouement mais les descriptions méthodologiques dans la littérature sont encore trop variées pour d’emblée permettrent une orientation sur l’une d’elles.
 Les premiers résultats de la recherche de microparticules obtenus comparativement entre les laboratoires de Marseille, Reims, Montpellier, Bordeaux, et Toronto avaient été discutés lors du précédent atelier à Reims. Notre premier choix comportait la recherche de microparticules dans du PPP, dans la perspective d’écarter toute la population plaquettaire. Le marqueur utilisé était un anticorps dirigé contre le complexe GP IIb-IIIa plaquettaire, l’anti-CD 42 conjugué au FITC. Les centrifugations sélectionnées comportaient une préparation de PRP suivie par une centrifugation à grande vitesse en centrifugeuse Eppendorf. Les moyennes obtenues, ayant été différentes selon les villes participant au projet avaient fait suspecter des différences sur les conditions de centrifugations. Ce point a été vérifié. Les résultats sont rapportés ci-après dans le rapport de l’équipe de Françoise Dignat-Georges. L’autre point de discussion était la nature du standard interne permettant une évaluation quantitative du nombre de microparticules présentes dans la circulation. Les premiers essais avaient utilisé les billes.
Les discussions soulevées lors de la réunion de Marseille et résumées ci-après ont aboutit à proposer une nouvelle approche de détections des microparticules. Une possibilité de contourner les obstacles décrits est d’évaluer directement les microparticules dans le sang total en définissant et différenciant les zones de microparticules et de plaquettes.
PLAQUETTES RETICULEES
PROPOSITION DE PROTOCOLE D'ETUDE
OBJECTIFS DE L'ETUDE
Le but du travail multicentrique est d'étudier l'intérêt des plaquettes réticulées en essayant de répondre au moins à une question : l'évaluation du taux ou du pourcentage de "plaquettes réticulées" chez un sujet thrombopénique apporte-t'elle des éléments d'orientation cliniquement utilisable dans le diagnostic du mécanisme, périphérique ou central, de cette thrombopénie?
Les problèmes méthodologiques posés par la quantification des plaquettes réticulées ne sont pas résolus. Le protocole proposé ici tient compte de différentes hypothèses. L'important est d'essayer de déterminer la relevance clinique du paramètre "événement thiazole orange positif " dans la fenêtre plaquettaire même si ce paramètre ne représente pas précisément les "plaquettes réticulées".
POPULATION ETUDIEE
Nous proposons d'étudier 40 sujets:
- 20 sujets normaux pour évaluation des normes et comparaison des normes inter laboratoire. Ces sujets normaux doivent avoir un hémogramme strictement normal et ne doivent pas avoir de pathologie dysimmunitaire, ni d'antécédent récent d'état infectieux ou inflammatoire. La prise fréquente ou récente d'aspirine ou d'anti-inflammatoire sont aussi des critères d'exclusion.
- 20 sujets thrombopéniques: cette population est composée de sujets avec thrombopénie sévère: plaquettes inférieures à 50 000/mm3, après élimination des fausses thrombopénies.
Répartition: 10 thrombopénies périphériques et 10 thrombopénies centrales.
- Patients sous chimiothérapie, il est nécessaire que cette chimiothérapie soit récente (moins de 5 jours après le début de la chimiothérapie) pour éviter de fausser les résultats par une régénération précoce. Le myélogramme dans ce cas n'est pas nécessaire.
- Problème du myélogramme. Il est bien sûr hors de question de faire un myélogramme pour l'étude: il faut choisir pour inclusion des patients qui ont ou ont eu un myélogramme (ce qui est le plus souvent le cas). Il suffit ensuite de récupérer le résultat de ce myélogramme: ce dernier examen, avec toutes ces limites et ces imprécisions reste le seul permettant d'éliminer une cause centrale (ce qui ne veut pas dire, que la thrombopénie est ipso facto "périphérique"). Il est important de savoir si la lignée mégacaryocytaire est normale sur cet examen.
PROTOCOLE:
Deux protocoles seront testés pour chaque patient:
1) Méthode en PRP
2) Méthode en sang total
Les protocoles précis et les modalités seront transmis aux participants du groupe
EQUIPES SOUHAITANT PARTICIPER:
CENTRE COORDONNATEUR
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Montpellier (Héri Rabesandratana, JF Schved)
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PLAQUETTES RETICULEES en Sang total
PROTOCOLE OPERATOIRE
proposé par Marseille
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Essai
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Contrôle
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5 µl sang total
200 µl PFA 1%
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5 µl sang total
200 µl PFA 1%
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30 mn à +4°C
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2 ml solution TO (10ng/ml)
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2 ml PBS
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1 h à Température Ambiante à l’obscurité
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Lecture par CMF
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ECHANTILLONS SANGUINS
Ponctionnés au pli du coude sur tube EDTA, analysés au maximum dans les 3 heures qui suivent le prélèvement.
REACTIFS
• Thiazole Orange : Sigma, Ref : 39006-2
Produit régénéré en méthanol, la solution mère est congelée à -80°C. Les dilutions à 10ng/ml sont préparées extemporanément à partir d’une solution à 50ng/ml (préparation hebdomadaire, conservée à +4°C).
• Paraformaldéhyde : Sigma , Ref : P-6148
1 g de PFA est dissout dans 100 ml de PBS à 56°C. Le pH est ajusté à 7,4 avec de la NaOH 1N avant utilisation.
PROTOCOLE en PRP proposé par Montpellier
MATERIELS ET REACTIFS :
1- PRP
Sang prélevé sur EDTA, centrifuger pendant 10 mn à 1000tr/mn. Prélever le surnageant, plasma riche en plaquettes.
2- Tampon TRIS
Tampon prêt à l'emploi (HELENA, référence n°5365)
3- TRAP
Peptide agoniste du récepteur de la Thrombine (NEOSYSTEM) : solution à 1 mg/ml dans du tampon PBS pH=7.2, aliquotée et congelée à - 80°C.
4- LIQUIDE DE GAINE
Tout liquide de gaine de cytomètre ou liquide de gaine Isoton II (COULTER).
5- THIAZOLE ORANGE :
Thiazole orange poudre (ALDRICH chem, référence n° 39,006-2)
Solution à 1 mg/ml dans le méthanol, aliquotée et conservée à +4°C à l'abri de la lumière.
Solution - mère : 4 µl de la solution à 1 mg/ml dans 2,5 ml d'Isoton II, à utiliser dans la journée et à conserver à +4°C, à l'abri de la lumière.
Solution de travail à préparer extemporanément : 100 µl de SM dans 3.9 ml d'Isoton II
6- PFA à 1 %
Paraformaldéhyde poudre (PROLABO), 1 g dans 100 ml de tampon PBS pH 7.2
MODE OPERATOIRE :
Répartir les réactifs suivant le tableau :
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Témoin
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Thiaz orange
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TRAP
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Tpon TRIS
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90 µl
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90 µl
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85 µl
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PRP µl
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10 µl
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10 µl
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10 µl
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TRAP
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0
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0
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5 µl
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Incuber
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10 mn
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à 37°C(BM)
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PFA
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100 µl
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100 µl
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100 µl
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Incuber
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15 min
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à 4°C
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Liq de gaine
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1800 µl
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800 µl
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800 µl
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Thiazole orange
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0
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1000 µl
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1000 µl
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Incuber
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60 mn
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4°C
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REGLAGE DU CYTOMETRE :
Créer un protocole "Plaquettes réticulées" utilisant trois histogrammes :
- Premier histogramme taille / structure en échelles logarithmiques (Log forward scatter en ordonnée et Log side scatter en abscisse). Tracer deux fenêtres (bitmaps), une pour les plaquettes (A) et l'autre (B) pour les billes de calibration Flow set (Coulter).
- Deuxième histogramme pour la fluorescence verte du Thiazole orange en échelle logarithmique) LFL1, conditionné sur la fenêtre (A) des plaquettes. Une région linéaire C est placée à partir de la division 1 (1 à 1024) pour délimiter et définir le pourcentage de plaquettes thiazole orange positives.
- Troisième histogramme LFL1 muni d'un curseur linéaire pour calibrer les appareils à l'aide des billes Flow set (Coulter Réf n°66 07 007) : la fluorescence des billes doit impérativement apparaître à une valeur donnée du pic (PkPosX) de cet histogramme pour que tous les participants lisent le pourcentage des plaquettes positives de la même manière. Cette position du pic peut être ajustée manuellement à chaque passage des billes Flow set en agissant sur le PMT de FL1. Pour les appareils Coulter munis d'une auto-calibration et du système II, contacter la société Coulter pour la mise en route éventuelle (non obligatoire) de ce procédé.
Pour les appareils BD, tenir compte d'un facteur de multiplication de l'ordre de 10 pour la position du pic.
LECTURE DES TUBES :
Avant de passer la série de tubes de plaquettes à analyser, passer un tube contenant dix gouttes de suspension de billes Flow set (bien agiter le flacon avant utilisation) pour ajuster la fluorescence des billes au Pic = 32 en LFL1.
Passer successivement pour chaque patient :
- le tube témoin (plaquettes)
- le tube thiazole orange
- le tube TRAP
RECUEIL DES DONNEES
Codage:
Il est nécessaire que ne figure ni nom ni prénom de patient mais simplement un numéro à 4 chiffres : les deux premiers correspondent à votre numéro de Centre, les deux derniers au numéro du patient étudié, numéro que vous attribuez vous-même et qui pourra vous permettre de revenir vers le dossier si nécessaire. Ceci permet d'éviter d'avoir à passer par la Commission Nationale Informatique et Liberté ce qui alourdirait inutilement le protocole.
Données biologiques:
Relever dans un tableau EXCEL
- votre code d'identification des patients
- taux d'hémoglobine
- taux de leucocytes
- le % des plaquettes thiazole orange positives
- le % des plaquettes thiazole orange positives après action du TRAP
Données cliniques
Le type de fiche clinique à remplir est proposé ci-joint.
TRANSMISSION DES DONNEES
Les données sont à adresser par e-mail, sous la forme définie ci dessus à [email protected]
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