25 Mars 2005

ATELIER CYTOMETRIE EN FLUX
Compte-rendu de la réunion de Paris

- Ce deuxième atelier de CMF a débuté par l’analyse des réponses au questionnaire. 55 centres ont répondu. Parmi ceux qui utilisent déjà la CMF, il s’agit essentiellement d’une utilisation dans le domaine du diagnostic des thrombopathies constitutionnelles, à l’aide de kits ou à l’aide de protocoles « maison ». Peu de centres parviennent à définir la place de la CMF dans la stratégie d’exploration des anomalies de l’hémostase primaire. Les souhaits de développement sont variés avec une prédominance pour le diagnostic des thrombopénies induites par l’héparine, point qui a été discuté pour la mise en place de protocoles (voir plus loin).

- Les différents paramètres à prendre en compte pour la standardisation ont été développés : les paramètres préanalytiques, la préparation de l’échantillon, les réactifs et diluants, les protocoles d’acquisition et d’analyse. Les billes de calibration dans les kits de quantification ou les billes Flow set permettent une standardisation des paramètres d’acquisition. Pour l’analyse, le curseur doit encadrer le pic pour les marqueurs fortement exprimés, et être positionné sur l’ensemble des plaquettes pour les marqueurs faiblement exprimés (CD62P, anticorps irrelevants). Les différences entre les cytomètres Coulter et Becton Dickinson (BD) ont été soulignées. Pour l’interprétation des résultats, il vaut mieux utiliser la geomean ou la médiane plutôt que la moyenne arythmétique. Le problème des compensations lors d’utilisation de plusieurs couleurs a été abordé. Dans une problématique de standardisation pour l’étude plaquettaire, il semble préférable dans un premier temps de se contenter de protocoles en simple couleur. L’expression des résultats est variable. Si on utilise des billes de calibration, le résultat est exprimé en nombre de site. Sinon, le résultat peut s’exprimer en MIF (geomean) ou en pourcentage d’inhibition ou d’augmentation de MIF par rapport à un état basal.

- L’utilisation du kit « platelet GP » sur cytomètre BD a été présentée. Les moyennes du nombre de sites (CD42b, CD41a, CD63 et CD62P) obtenus sur 19 témoins adultes sont proches de celle indiquées par le fabricant. Toutefois, la fourchette pourrait être affinée en ce qui concerne le CD62P après activation. La concentration de TRAP utilisée est élevée. La possibilité d’activer dans d’autres conditions pourrait permettre d’être plus sensible pour la détection d’anomalie d’activation plaquettaire.

- Lors de la présentation concernant le dépistage des thrombopathies de sécrétion, il a été rappelé que selon les données de la littérature, les profils d’agrégation avec les agonistes classiques peuvent être normaux dans les thrombopathies de sécrétion. L’intérêt du test à la mépacrine par CMF pour dépister les anomalies de sécrétion des granules denses est sujet à débat. Ce test n’est pas aussi sensible que le test à la mépacrine en microscopie mais la microscopie nécessite des techniciens très expérimentés. En fait, la mépacrine par CMF n’a jamais été validée. Il s’agit d’un test simple qui pourrait faire l’objet d’un protocole multicentrique (voir plus loin). Certains centres utilisent encore la luminoagrégométrie, mais c’est très coûteux et donc difficilement généralisable.
L’utilisation du kit platelet calibrator avec un anticorps anti CD62P permet d’étudier la sécrétion des granules _ dans des conditions d’activation différentes de celle du kit « platelet GP » ce qui pourrait permettre un dépistage plus sensible des thrombopathies de sécrétion des granules alpha.

- La CMF est un outil supplémentaire d’explorations des anomalies plaquettaires chez la patients ayant une symptomatologie hémorragique. Doit-elle venir en 2ème ou 3ème intention après le bilan Willebrand et / ou l’agrégométrie ?. Si oui, doit-elle être décidée en fonction des résultats obtenus en agrégation ? Quoiqu’il en soit, il nous a semblé intéressant de rediscuter du problème de la standardisation de l’agrégation plaquettaire qui est loin d’être résolu tant au niveau des conditions de sa réalisation que de son interprétation. Nous allons tenter d’unir nos efforts avec le groupe du réseau « maladies rares » chargé de la standardisation de l’agrégation plaquettaire pour essayer d’avancer dans ce domaine. Il est prévu que le groupe CMF et le groupe standardisation se réunissent ensemble au prochain GEHT à Grenoble.


Discussion de protocoles

1/ Afin de préciser l’intérêt du test à la mépacrine par CMF, un protocole multicentrique est envisagé. Il sera rédigé par Dominique Lasne. Il convient de définir les critères d’inclusion en fonction de données cliniques. Compte tenu de l’impossibilité d’envisager la comparaison à un gold standard dans tous les centres, il faut définir avec un statisticien le nombre minimal de patients à inclure en fonction de la fréquence des anomalies de sécrétion des granules denses décrites dans la littérature (22% dans une population ayant une symptomatologie hémorragique selon Quiroga et al, JTH, 2004, 2 : 892-898). La possibilité de tester en parallèle la détection de la sérotonine par CMF selon Maurer-Spure et al, BJH, 2002, 116, 604-611 est à l’étude.
Pour info, la concentration finale de mépacrine (Sigma) utilisée dans le protocole qui a été présenté est de 14 µM (10 µl d’une solution 0,25 mg/ml de mepacrine SIGMA, PM : 508,9).

2/ Devant l’intérêt manifesté dans les réponses au questionnaire pour le diagnostic de TIH par CMF, un protocole visant à déterminer l’intérêt de cette technique pourrait être envisagé. Deux centres identifiés l’utilisent déjà : l’un en Belgique, l’autre à Besançon. Bernard Châtelain a déjà entrepris une comparaison avec le test considéré actuellement comme le Gold Standard à savoir la libération de sérotonine marquée en envoyant les plasma testés en CMF à Yves Gruel à Tours. Il est envisagé de contacter la biologiste de Besançon pour faire une comparaison identique à Reims et définir les performances de cette détection par CMF avant d’envisager de la généraliser. La description récente dans la littérature d’une technique combinant la détection des antiHPF4 et leur propriétés d’activer les plaquettes en présence d’héparine pourrait avoir un intérêt ("new laboratory test in flow cytometry for the combined analysis of serologic and cellular parameters in the diagnosis of HIT" Cytometry, 2004;58B:32-38).

3/ Un protocole de recherche d’immunoglobulines associées aux plaquettes sera prochainement proposé par Philippe Nguyen et Nathalie Hézard.


Conclusion de la journée

Afin de répondre aux attentes des personnes souhaitant une initiation pratique à la cytométrie en flux, nous prévoyons de nous adresser à des organismes spécialisés dans la formation pour permettre la mise à disposition d’un nombre suffisant de cytomètres pour envisager un atelier pratique.